Antibodi pengujian Produsen obat menentukan teknik untuk menganalisis kelas tumbuh dan beragam terapi Dengan Jyllian Kemsley

Monoklonal-obat berbasis antibodi adalah segmen besar dan berkembang dari obat-obatan. Sejak muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3) pertama kali disetujui oleh Food & Drug Administration pada tahun 1986 sebagai obat antipenolakan untuk pasien transplantasi organ, lebih dari 30 obat berbasis antibodi telah memasuki pasar, dan banyak lagi yang di dalam pipa. Pada tahun 2011 saja, disetujui FDA belimumab (Benlysta) untuk lupus, ipilimumab (Yervoy) untuk melanoma metastatik, dan vedotin brentuximab (Adcetris) untuk dua jenis limfoma. Perusahaan riset pasar Datamonitor memperkirakan bahwa penjualan terapi antibodi akan tumbuh sebesar 8,2% 2010-2016, yang tercepat dari setiap kelas terapi, dengan penjualan diperkirakan akan melampaui $ 65000000000 pada tahun 2016.
Meskipun obat berdasarkan antibodi monoklonal-mAbs-telah secara luas bervariasi tindakan terapeutik, mereka semua didasarkan pada protein yang sama, imunoglobulin G (IgG). Tapi ini atribut bersama tidak berarti bahwa obat ini sederhana untuk pengujian. MAbs terdiri dari lebih dari 1.000 asam amino dalam empat rantai peptida, dan mereka menanggung gula dan modifikasi kimia lainnya.
Sebagai kelas MAb tumbuh, para ilmuwan menetap di beberapa kualitas protein standar kritis dan pendekatan pengujian analitis untuk identitas obat, kualitas, dan kemurnian untuk ini, molekul besar yang kompleks.
Di sepanjang baris, AS Pharmacopeial Konvensi (USP), organisasi penetapan standar farmasi di AS, adalah di tengah-tengah mengembangkan "praktek terbaik" pedoman dan standar peraturan untuk pengembang obat MAb. "Industri ini memiliki lebih dari 20 tahun pengalaman manufaktur dengan jenis molekul, dan kami melihat produk yang sangat murni dan benar-benar baik ditandai," kata Tina S. Morris , wakil presiden USP untuk biologi dan bioteknologi. "Setiap antibodi pemurnian sedikit berbeda dan karakteristik analitis, tapi kau tidak pernah mulai dari nol dengan protein-benar tidak diketahui."
Satu set standar, dikenal sebagai Bab 1260, akan berfokus pada bagaimana mengembangkan, menentukan atribut kualitas, dan mAbs manufaktur.
Standar-standar ini tidak akan secara hukum mengikat MAb produsen tetapi dimaksudkan untuk memberikan pedoman praktek terbaik di seluruh dunia, kata Anthony Mire-Sluis, wakil presiden perusahaan untuk kualitas produk dan perangkat di Amgen dan ketua Panel USP rekombinan monoklonal Antibodi Terapi Ahli, yang sedang mengembangkan standar. Panel pakar termasuk 13 anggota industri, serta tujuh perwakilan dari peraturan dan standar lainnya penetapan lembaga.
Yang lain standar, Bab 129, akan secara hukum mengikat dan menguraikan produsen MAb kualitas minim atribut umum untuk semua antibodi dan tes analitis yang sesuai direkomendasikan untuk terapi MAb. Beberapa perusahaan akan memvalidasi metode yang diusulkan untuk memastikan bahwa mereka bekerja, dan standar juga akan mencakup batas yang berasal dari data produsen pada produk sebenarnya. Tapi, Mire-Sluis catatan, perusahaan akan mampu membenarkan menggunakan tes yang berbeda atau batas sebagai bagian dari paket aplikasi mereka obat jika mereka berpikir produk mereka manfaat sesuatu yang atipikal.
[+] Memperbesar
09003-cover-chains
KONFIGURASI
Struktur IgG dasar melibatkan dua rantai berat dan dua rantai ringan yang diselenggarakan bersama oleh ikatan disulfida dan interaksi noncovalent. Protein dapat glikosilasi di sebuah situs kekal (ditampilkan) atau di tempat lain pada struktur.
Secara struktural, antibodi, atau imunoglobulin, adalah besar, berbentuk Y protein terdiri dari dua "berat" dan dua "cahaya" rantai peptida. Rantai berat datang bersama-sama di bagian bawah Y, juga disebut fragmen crystallizable, atau Fc. Obligasi disulfida dan interaksi noncovalent memegang rantai bersama-sama. Ini bagian dari antibodi memiliki urutan asam amino dan dilestarikan mengikat reseptor untuk mengaktifkan bagian-bagian dari sistem kekebalan tubuh. Berbeda antibodi IgA kelas-, IgD, IgE, IgG, dan IgM-memiliki rantai berat yang berbeda yang menentukan peran imunologi spesifik. IgG menyediakan sebagian besar kekebalan tubuh untuk menyerang patogen.
Pada bagian atas Y antibodi, rantai berat cabang dan masing-masing asosiasi dengan rantai ringan, juga melalui ikatan disulfida dan interaksi noncovalent. Ini wilayah antibodi disebut fragmen antigen mengikat, atau Fab, dan di sini bahwa urutan asam amino bervariasi untuk mengikat molekul-molekul asing macam: Kedua lengan antibodi spesifik memiliki urutan asam amino yang sama, sedangkan bagian variabel berbeda antara molekul antibodi yang berbeda.
Tapi karena mAbs yang dibuat oleh garis sel kloning dengan sel yang identik, semua antibodi yang diproduksi oleh garis sel direkayasa untuk menghasilkan terapi tertentu harus identik. Monoklonal IgG terapi awalnya didasarkan pada antibodi tikus, tetapi mereka sekarang dapat chimeric, yang berarti urutan part-mouse/part-human, atau "sepenuhnya" manusia. Secara struktural, tiga jenis yang sangat mirip, tetapi mereka dapat menimbulkan respon imun yang berbeda pada pasien.
Selain kemiripan struktur dasar mereka, terapi MAb juga cenderung dimurnikan sama, Morris USP catatan. Pemurnian biasanya dimulai dengan kromatografi afinitas menggunakan fase padat yang jangkar protein A, protein bakteri yang selektif mengikat ke wilayah Fc antibodi dilestarikan '. Setelah itu, obat ini akan diperlakukan untuk menonaktifkan virus mengkontaminasi dan dapat menjalani fine-tuning langkah pemurnian. Kebanyakan antibodi juga saat ini diproduksi dari dua baris sel yang populer, yang berarti bahwa profil kenajisan mereka serupa. Kombinasi dari kultur sel yang serupa dan pemurnian, di atas menargetkan protein yang sama, lanjut meminjamkan analisis MAb terapi untuk protokol yang sama, Morris mengatakan.
Tapi meski kesamaan, mAbs mungkin menunjukkan heterogenitas tergantung pada bagaimana mereka diproduksi dan diproses oleh sel-sel mereka berasal. Masalah dengan terjemahan DNA atau transkripsi dapat menyebabkan urutan protein yang berbeda. Protein dapat misfold atau ketidakcocokan ikatan disulfida mereka. Posttranslational modifikasi dapat menghasilkan pola glikosilasi yang berbeda. Rantai samping juga dapat dikenakan untuk reaksi kimia, seperti oksidasi atau deamidation. Enzim proteolitik dapat klip protein, terutama lysines di ujung rantai berat di Fc tersebut. MAbs juga dapat denaturasi atau agregat ketika mereka pergi melalui pemurnian atau formulasi.
Karena efek ini, bahkan sempurna disiapkan MAb terapi akan mencakup protein IgG dengan struktur bervariasi dan sifat, kata William Whitford, pasar manajer senior untuk kultur sel dan Bioprocessing di Thermo Fisher Scientific . "Tidak seperti obat molekul kecil, biologis menunjukkan distribusi molekul yang sedikit berbeda," katanya. Tantangan analitis Oleh karena itu untuk memastikan bahwa distribusi populasi tidak berbeda secara signifikan dari obat yang dikembangkan, diuji klinis, dan disetujui.
Beberapa sifat bendera proses merah. Oksidasi atau deamidation, misalnya, dengan sendirinya umumnya tidak mempengaruhi fungsi klinis antibodi, kata Raymond Kaiser, ilmu pengetahuan pemimpin global dan wakil presiden untuk layanan bioteknologi di Covance , obat kontrak perusahaan pengembangan. Tapi variabilitas dalam kategori tersebut biasanya merupakan tanda bahwa proses manufaktur tidak dikontrol dengan baik, dan karakteristik protein lain, seperti agregasi, mungkin akan terpengaruh, kata Kaiser.
Modifikasi lain yang menjadi perhatian klinis. Sebuah protein yang gagal melipat atau satu dengan ikatan disulfida yang abnormal mungkin tidak akan memiliki struktur yang diperlukan untuk berfungsi dengan baik. Selain itu, IgGs memiliki situs glikosilasi dilestarikan pada Fc, namun variasi pada mereka gula dan glikosilasi pada protein lain mungkin mendapatkan respon imunologi yang tidak diinginkan, seperti anafilaksis. Agregat protein juga dapat memprovokasi respon kekebalan tubuh.
Dan sehingga suite tes analitis diperlukan untuk memastikan bahwa terapi MAb berada dalam batas-batas obat yang aslinya dibuat, diuji, dan disetujui. "Anda hidup dan mati oleh analyticals Anda," kata Kaiser. "Jika Anda tidak memiliki analyticals Anda, Anda tidak tahu apa-apa."
Urutan pertama bisnis sering untuk mengidentifikasi apakah produsen telah membuat protein yang benar. Salah satu pendekatan umum adalah untuk melakukan immunoassay, seperti assay enzyme-linked immunosorbent (ELISA). Dalam jenis tes, fase padat stasioner yang sarat dengan molekul yang akan mengikat antibodi khusus untuk target. Sebuah sampel obat dimuat, diinkubasi, dan dicuci, dan beberapa jenis label yang digunakan untuk uji apakah dan seberapa banyak target antibodi terikat.
Pilihan lain untuk mengidentifikasi protein adalah pemetaan peptida, yang melibatkan menggunakan enzim protease untuk membelah antibodi ke dalam segmen karakteristik yang kemudian dapat dipisahkan dengan elektroforesis gel atau kromatografi kolom untuk menghasilkan sidik jari tertentu.
Di depan kualitas, tes seperti pertukaran ion kromatografi, isoelektrik fokus, atau elektroforesis kapiler akan mengambil variasi yang bertanggung jawab dalam struktur protein yang mungkin menunjukkan oksidasi, deamidation, atau kliping protein. Dalam pertukaran ion kromatografi, bagaimana protein berinteraksi dengan fase diam dibebankan menentukan seberapa cepat mereka mengelusi. Isoelektrik fokus mengambil keuntungan dari fakta bahwa biaya protein fungsi dari pH dan memisahkan protein menggunakan gel dengan gradien pH. Elektroforesis kapiler memisahkan protein dengan menerapkan medan listrik ke tabung kapiler dan dapat dilakukan baik menggunakan solusi gratis (elektroforesis zona kapiler) atau gel (elektroforesis gel kapiler).
Untuk glikosilasi, produsen sering membuat peta glycan mirip dengan peta protein. Antibodi ini enzimatis atau diolah secara kimia untuk menghilangkan gula, yang kemudian diberi tag neon dan dipisahkan menggunakan kinerja tinggi atau kromatografi cair ultraperformance. Identitas glycans 'menentukan kapan mereka mengelusi dari kolom. Asam sialic, bagaimanapun, membutuhkan pendekatan yang berbeda. Karena mereka dihancurkan oleh perlakuan asam standar untuk menghapus gula, mereka malah dihapus menggunakan asam ringan dan kemudian dianalisis dengan pH tinggi kromatografi pertukaran anion dengan deteksi elektrokimia.
Untuk lebih dijabarkan secara spesifik modifikasi kimia atau perubahan pola glikosilasi, kromatografi cair-spektrometri massa (LC / MS) telah menjadi pendekatan standar. Antibodi atau gula yang dicerna dan terpisah seperti dalam tes lain, tetapi fragmen yang dihasilkan dianalisis menggunakan spektrometri massa. LC / MS memberikan identifikasi yang tepat dari massa fragmen tetapi membutuhkan operator yang sangat terampil, sehingga banyak digunakan dalam pengembangan atau pemecahan masalah, kata Taegen Clary, manajer pemasaran untuk biopharmaceuticals di Agilent .
Namun demikian, LC / MS data telah menjadi bagian penting dari paket aplikasi obat untuk menunjukkan bahwa produsen mengerti apa yang mereka lihat dalam pengendalian kualitas suite mereka dari tes. "Saya percaya bahwa jika Anda tidak memberikan beberapa LC / MS data dalam sebuah paket, Anda akan diminta untuk itu karena sangat umum sekarang," kata Covance yang Kaiser.
Untuk mengambil agregasi, satu pendekatan adalah hanya untuk melihat sebuah larutan protein. Jika agregat cukup besar, solusi akan terlihat kabur daripada jelas. Untuk memeriksa untuk partikel yang lebih kecil, ukuran-pengecualian kromatografi, juga dikenal sebagai gel filtrasi kromatografi-, adalah metode standar, dengan deteksi baik oleh penyerapan cahaya ultraviolet atau sinar laser multiangle hamburan.
Teknik lain untuk mencari agregasi termasuk mengaburkan cahaya dan pencitraan microflow. Microflow pencitraan adalah teknik mikroskop yang memungkinkan para ilmuwan untuk membedakan, misalnya, apakah partikel terdiri dari protein atau minyak silikon, yang digunakan dalam formulasi obat sebagai pelumas untuk jarum suntik. Mereka teknik serta ultrasentrifugasi analitis dapat digunakan dalam pengembangan untuk membantu memahami agregasi antibodi atau dalam produksi untuk mendiagnosa masalah, Kaiser mengatakan, tapi pekerja keras proses throughput tinggi ukuran-pengecualian kromatografi.
Selain dari kualitas dari molekul IgG, produsen juga harus menjaga mata pada kemurnian larutan obat. Kotoran umum bahwa produsen menonton untuk mencakup DNA residu atau protein lain dari sel inang, ditambah protein A yang mungkin dilakukan melalui pemurnian. Kuantitatif real-time polymerase chain reaction (Q-PCR) metode yang digunakan untuk memperkuat dan mengukur DNA, sementara ELISA target protein A dan protein sel inang. Pada perkembangan awal, produsen mungkin menggunakan sel-line-spesifik ELISA kit yang mengandung antibodi terhadap protein selular umum. Pada akhir-tahap pengembangan, bagaimanapun, perusahaan sering mengembangkan proses-spesifik tes dengan mengambil sel-sel yang tidak menghasilkan terapeutik melalui proses pemurnian dan menggunakan output untuk mengembangkan antibodi terhadap protein apapun tetap, Kaiser mengatakan.
Salah satu bidang tambahan analisis MAb adalah tes untuk potensi. Tes potensi, bagaimanapun, tidak bisa dengan mudah menjadi standar di seluruh kelas. Tindakan klinis yang berbeda dengan kebutuhan memerlukan tes potensi yang berbeda, yang sering berbasis sel tes di mana menambahkan produk obat memunculkan beberapa jenis respon terukur.
Apa yang sedang menatap juga menjadi pertimbangan, apakah itu protein IgG sendiri; konjugat antibodi-obat, yang menambatkan obat molekul kecil ke IgG, antibodi atau protein fusi, yang biasanya menggabungkan komponen IgG Fc dengan protein lain. Untuk konjugat antibodi-obat, tes kebanyakan akan sama dengan yang untuk IgGs tak terkonjugasi, tetapi para ilmuwan mungkin membayar lebih memperhatikan alat tes pemetaan peptida untuk memastikan mereka tahu di mana dan bagaimana berhasil molekul kecil yang menempel, Kaiser mengatakan. Untuk protein fusi, produsen mungkin akan beralih ke alat-alat analisis yang sama seperti untuk IgGs utuh, tetapi mereka harus melakukan pekerjaan pembangunan yang lebih untuk mengoptimalkan tes dan memahami apa data menunjukkan.
Banyak metode analisis umumnya digunakan pada mAbs, seperti ELISA, prosedur biaya pemisahan, atau ukuran-pengecualian kromatografi, adalah waktu-teknik biokimia dihormati, kata Martina Bielefeld-Sevigny , wakil presiden dan general manager dari penemuan obat dan reagen penelitian di PerkinElmer . Mendorong sekarang adalah untuk membuat metode-metode lebih cepat dan lebih mudah, dengan presisi yang lebih baik, akurasi, reproduktifitas, dan sensitivitas. Dalam banyak kasus, itu berarti akan mikofluida, lab-on-a-chip platform yang menggunakan jumlah yang lebih kecil bahan, memberikan waktu respon lebih cepat, dan memungkinkan tinggi-throughput analisis.
"Saya berpikir bahwa industri monoklonal perintis," kata USP Morris. Menunjuk sebagai contoh untuk penggunaan umum teknik kapiler bukan elektroforesis gel biasa, ia menambahkan, "Saya pikir mereka menggunakan teknik analisis yang cukup canggih dibandingkan dengan plasma atau orang-orang industri peptida."
Itu sesuatu yang konsumen dapat menghargai, untuk jaminan tambahan bahwa obat akan bekerja seperti yang diiklankan.
Kimia & Engineering News
ISSN 0009-2347
Hak Cipta © 2012 American Chemical Society

You Might Also Like

0 comments